REKOMBİNANT DNA
Rekombinant Nedir?
1980’lerin başında geliştirilen rekombinant teknoloji, deoksiribonükleik asit (DNA) kullanarak hormon üretim yöntemidir.
Rekombinant DNA teknolojisi
Rekombinant DNA teknolojisi, doğada kendiliğinden oluşması mümkün olmayan, çoğunlukla farklı biyolojik türlerden elde edilen DNA moleküllerinin, genetik mühendislik teknolojisiyle kesilmesine ve elde edilen farklı DNA parçalarının birleştirilmesi işlemlerini kapsayan bir teknolojidir. Rekombinant DNA ise; bu işlem sonucu üretilmiş olan yeni DNA molekülüne verilen isimdir ve kısaca rDNA olarak yazılır.
Bu alanda yapılan işlemler, kısaca genlerin herhangi bir organizmadan alınarak üretilmesi (klonlama) ve üretilen genlerin gerek temel, gerekse uygulamalı araştırmalar için kullanıması olarak özetlenebilir. Bu teknoloji bugün temel bilimler, tıp, endüstri, hayvancılık, ziraat, çevre mühendisliği gibi alanlarda yaygın bir biçimde kullanılmaya başlamıştır.
Tanım ve amaç
Bu teknolojinin bilimsel temeli olan çeşitlenme (rekombinasyon) genetik bir olaydır ve doğada canlılar arasında görülen çeşitliliğin önemli nedenlerinden birini oluşturur. Rekombinasyon; farklı genotipteki bireyler arasında eşleşmeler söz konusu olduğunda, ana-babaya ait kalıtsal özelliklerin dölde değişik gruplanmalar halinde bir araya gelmesine yol açan olaylar dizisidir. Bu olay moleküler düzeyde, farklı nükleotid dizilerine sahip iki DNA molekülünün homoloji gösteren bölgeleri arasındaki parça alış-verişi sonucunda meydana gelen yeni gruplamalardır. Bunun için DNA molekülleri arasında kırılmalar meydana gelir ve kırılma bölgelerinde DNA molekülleri arasında parça alış-verişi oluşur. Sonuçta orijinal durumdaki DNA moleküllerine tam olarak benzemeyen ve onlara ait nükleotid dizilerini kısmen taşıyan rekombinant DNA molekülleri oluşur.
Homolog çeşitlenme (rekombinasyon), eşeyli üremeyle genelde mayoz bölünmedeki kromozomal parça değişimi sonucunda meydana gelir. Bakterilerde çeşitlenme farklı işleyişlerle, transformasyon, konjugasyon ve trandüksiyon olaylarıyla görülür. Bu olayların hepsinin temeli DNA molekülleri arasında homoloji olmasına dayanmaktadır. Bu yüzden doğada çeşitlenme, aynı türe ait bireyler arasında ya da çok yakın türler arasında kısıtlıdır. Farklı türler arasında varolan çeşitli düzeydeki eşleşme engelleri farklı türlere ait bireyler arasında genetik bilgi aktarımına, dolayısıyla da rekombinasyona olanak sağlamamaktadır.
Rekombinant DNA teknolojisinin tanımı ve kapsamı çeşitli toplumlara ya da biliminsanlarına göre farklılıklar göstermektedir. Bununla birlikte, bu değişik tanımlar arasında hepsindeki ortak yönleri birleştiren, oldukça geniş ve günümüzün modern ölçütlerine uygun bir tanım şu şekilde yapılabilir: Rekombinant DNA teknolojisi, bir canlıdan herhangi bir yolla yalıtılan bir genin uygun bir konağın içerisine sokularak orada çoğaltılmasını ve bazen de ifade edilmesini amaçlayan çalışmalar ait tekniklerin toplamıdır.
Belirli bir amaç için doğrudan genetik materyal üzerinde yapılan bu teknolojiyle, in vitro şartlarda genetik materyalde planlı değişiklikler yapılabilmekte, istenilen genlerin istenilen canlıya sokularak, doğal biçimde bulunmadığı bu konakta çoğaltılması ve istenilen ürünü vermesi için nakledilen genin ifadesi sağlanabilmektedir. Bu teknolojiyle, prokaryotik ve ökaryotik gruplara ait türlerin kendi aralarında olduğu kadar, gruplar arasında da gen aktarımları yapmak ve çeşitlilikler meydana getirmek mümkün olmaktadır.
Tarihçe
Rekombinant DNA teknolojisi özellikle 1960’lı yılların sonlarına doğru DNA ile ilgili bazı enzimlerin etki mekanizmalarının anlaşılması sayesinde gerçekleştirilen bir dizi yöntemleri kapsamaktadır. Bununla birlikte bu süreç 1940’lardan 70’lere kadar moleküler biyolojinin gelişmesini sağlayan bilgi birikimi de rekombinant DNA teknolojisinin temelini oluşturmuştur.
Genetik çeşitlenme olaylarının yapay olarak gerçekleştirilmesi esasına dayanan rekombinant DNA teknolojisine (rDNA) ilişkin ilk çalışmalar, 1973 yılında başta Cohen olmak üzere bir araştırma grubunun önderliğinde in vitro koşullarda gerçekleşmiştir. Buna göre doğada eldesi imkânsız olan yeni gen düzenlemelerinin yapılması bu teknolojiyle sağlanabilmekte, bir canlının genotipi önceden belirlenebilmekte ve yönlendirilebilmektedir. In vitro koşullarda oluşturulan yeni DNA moleküllerine önceleri "kimera" (aslan başlı, keçi gövdeli ve yılan kuyruklu mitolojik bir yaratık) adı verilmiştir. Bu kimeralar, birbirleriyle ilişkili olmayan ve farklı kökenler ait genleri içeren rekombinant DNA molekülleridir.
Rekombinant DNA teknolojisi 1980’li yıllarda dev adımlarla ilerlemiş ve günümüzde adından en çok bahsedilen ve moleküler genetikte devrim yaratan bir bilim dalı olmuştur.
Özellikle 1985’de ortaya atılan bir veya iki hücreden elde edilen DNA’nın birkaç saat içersinde çoğaltılarak 24 saatte genetik tanının konmasına olanak sağlayan Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) rDNA teknolojisi için belki en büyük gelişmelerden biri olarak kabul edilebilir.
Uygulama
Rekombinant DNA teknolojisinde izlenen olayların sırası şu şekilde özetlenebilir;
Bir canlıdan elde edilen, istenilen özellikteki (yalıtılmış) DNA parçalarının taşıyıcı özellikteki bir DNA molekülüne (vektöre) bağlanması ve rekombinant DNA eldesi,
Rekombinant DNA moleküllerinin uygun bir konak hücreye sokulma (transformasyon, transdüksiyon veya konjugasyon ile)
rDNA’nın konak hücrede çoğaltılması (gen çoğaltımı) ve hücre bölünmesi,
Yavru hücrelerde yeni genin ifadesi ve ürünün eldesi.
Rekombinant DNA teknolojisinde uygulanan yöntemler 3 ana başlık halinde incelenebilir;
Klasik uygulamalar
Hibritleşme yöntemleri
Polimeraz zincir reaksiyon yöntemi
Rekombinant DNA teknolojisi uygulamaları özellikle genetik mühendisliği ve biyoteknolojide kullanılımaktadır. Dünya nüfusunun %3-5’nin genellikle tedavi olanağı bulmayan kalıtsal hastalıklardan etkilendiği bilinmektedir. Bu alandaki en büyük ümit ve beklenti genetik bozuklukların gen aktarımı yöntemleriyle düzeltilmesi ya da etkin tedavi yöntemlerinin geliştirilmesidir. Kısa zamanda çok geniş bir uygulama alanı bulan bu yöntemin gerçek değeri önümüzdeki yıllarda çok daha iyi anlaşılacaktır.
Genetik Mühendisliği
Genetik mühendisliği, canlıların kalıtsal özelliklerinin değiştirilerek, onlara yeni işlevler kazandırılmasına yönelik araştırmalar yapan bilim alanıdır. Bu uygulamalarla uğraşan bilim insanlarına "genetik mühendisi" denir. Genetik mühendisleri, genlerin yalıtılması, çoğaltılması, farklı canlıların genlerinin birleştirilmesi ya da genlerin bir canlıdan başka bir canlıya aktarılması gibi çalışmalarla uğraşırlar. Genetik mühendisliği için, rekombinant DNA teknolojisi, gen klonlaması, DNA klonlaması, genetik manüplasyon/modifikasyon veya gen ekleme (splays) birçok bilim insanınca eş anlamlı olarak kullanılabilmektedir.
Genetik mühendisliği etki alanı son derece geniş bir meslek, bilim ve mühendislik dalı olup, genlerle yapılabilen uygulamalar, çalışmalar anlamına gelmektedir. Birçok bilim dalına ait bilgilerin ve çeşitli özel tekniklerin, canlılarla ilgili temele ve uygulamaya ait sorunların çözülmesi için genellenecek olursa, moleküler biyoloji hakkındaki bilgimizin artmasına yardım eden çok etkili bir araştırma aracıdır da.
Gregor Mendel genetiğin ve bu bilimle ilgili yapılan çalışmaların kurucusu olarak kabul edilip, "Genetiğin Babası" olarak anılmaktadır.
Gen yalıtımı (izolasyonu)
Gen yalıtımı veya izolasyonu, rekombinant DNA teknolojisinde, bir canlıya herhangi bir genin istenilen yön ve biçimde yeni bir düzenleme içine sokulmasındaki ilk aşamadır. Bu yöntemle ilgilenilen geni taşıyan DNA parçaları elde edilir. İşlem için değişik yollar kullanılabilir. Bu yöntemler şu şekilde sıralanabilir:
1. Genellikle kullanılan yöntemlerden biri, bir canlıdan yalıtılan ve saflaştırılan DNA moleküllerini, çift zincirli yapılarını bozmadan parçalamaktadır.
Çoğaltılması istenilen gen parçaları bu parçalardan birinin içinde bulunur. DNA’nın parçalanması için bazı mekanik (kontrollü çalkalama, ultrason uygulaması gibi) yöntemlerden yararlanılmakta birlikte, günümüzde en başarılı sonuçlar kesme enzimleri (restriksiyon endonükleazlar) ile sağlanmaktadır.
2. Diğer bir yöntem ise DNA kopyasının (cDNA) eldesidir.
Bunun için hücrelerden klonlanması amaçlanan genin transkripsiyon ürününü de içeren RNA yalıtılır. Daha sonra ters (revers) transkriptaz enzimiyle bu RNA moleküllerinin tamamlayıcısı olan DNA kopyaları çıkarılır. Meydana gelen RNA/DNA melezinin RNA kısmı enzimin ribonükleaz H aktivitesiyle hidroliz edilip yok edilir, daha sonra DNA polimeraz aktivitesiyle cDNA çift zincirli hale getirilir. Bu yöntem özellikle fazla miktarda DNA içeren karmaşık gen yapısı gösteren ve çoğu geninde intron bulunan ökaryotik canlılardan gen yalıtımı için kullanılmaktadır. Elde edilen DNA parçalarının içinde bazıları çoğaltılmak istenilen gen parçasını taşırlar. Farklılaşmış ve çok az çeşitte proteinlerin sentez edildiği hücrelerde ise bu olasılık daha yüksek olur. Bu yöntem özellikle ökaryotik genlerin prokaryotlara klonlanmasında kullanılmaktadır.
3. Son yıllarda çok başarılı sonuçlar sağlayan başka bir yöntem de, Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) ile gen yalıtımıdır.
1986 yılında geliştirilen PCR yöntemi DNA moleküllerindeki istenilen gen bölgesinin canlı hücre içine sokulmadan yalıtılıp çoğaltılmasına olanak verir. Genomdan seçilen küçük miktardaki bir gen bölgesinin bile milyonlarca kopyası bu yöntemle yapılabilmektedir. Bunun için sadece bu dizinin, en azından bir kısmının önceden biliniyor olması gerekmektedir. PCR ürünü DNAlar klonlamanın yanı sıra dizi analizi, hastalık tanısı, genetik tarama gibi çeşitli amaçlar için de kullanılabilmektedir. PCR, rekombinant DNA teknolojilerinin etkinliğini ve gücünü arttırmış, hatta bazı yöntemlerin yerini almıştır.
Gen çoğaltımı (klonlaması)
Moleküler klonlama, Gen çoğaltımı veya Gen klonlaması, rekombinant DNA moleküllerinin uygun bir konak hücreye sokularak orada çoğaltılması işlemine verilen addır.
Rekombinant DNA teknolojisi genelde, bir organizmadan elde edilen ve içinde istenilen geni taşıyan DNA parçalarının, taşıyıcı özellikte bir DNA molekülüne bağlanarak rekombinant DNA (cDNA) oluşturulması, rekombinant DNA moleküllerinin uygun bir konak hücreye sokularak orada çoğaltılmasını kapsayan bir süreci izlemektedir. Bu sürecin tanımlanmış bir DNA dizisinin yalıtımı (izolasyonu) ve daha sonrasında bunun birçok kopyasını in vivo koşullarda üretme aşamalarını kapsayan kısmı ise gen klonlamasıdır.
Klonlama, çoğunlukla gen içeren DNA parçalarının kuvvetlendirilmesi için kullanılsa da, DNA’nın promotorlar, kodlanmamış diziler, kimyasal sentezlenmiş oligonükleotidler gibi kısımlarını ve nadiren kırılmış DNA’yı kuvvetlendirmek için de kullanılabilir.
Bu süreçte konak hücreler çoğladıkça rekombinant DNA molekülleri döllere geçerler ve yavru hücrelerde de kopya sayılarını arttırırlar. Çok sayıda hücre bölünmesini takiben oluşan bir klonda hücrelerin her birinde istenilen geni taşıyan cDNA moleküllerinin bir ya da daha fazla sayıda kopyası bulunur. Buna göre, gen klonlaması (ya da DNA klonlaması) tek bir genden kökenlenen ve hepsi birbirinin ayn olan bir DNA populasyonu elde etmektedir. Bu teknolojiyle ayrıca çoğu kez klonlanmış bir genin kendisi için yeni konakta ifade edimin (ekspresyonun) sağlanmasıyla ürünün eldesi de amaçlanmaktadır.
Moleküler klonlama, biyoloji deneylerinin ve yüksek oranda protein üretimi gibi teknolojik uygulamaların çoğunda yarar sağlamaktadır
Hibritleşme
DNA hibritleşmesi; birbirine eşlenik iki adet tek sarmal nükleik asit dizisinin çift sarmallı tek bir yapı haline gelmesi işlemidir.
Yapay olarak çoğaltılmış ve DNA probları olarak hazırlanmış olan spesifik DNA frangmentlerinin niteliği araştırılacak olan hedef DNA molekülü ile birleştirilmesi işlemine "hibridizasyon" denir.
Nükleotitlerin, normal şartlar altında kendilerine karşılık gelen eşlerine bağlanma özellikleri vardır. DNA’da Guanin ile Sitozin ve Adenin ile Timin birbirine komplemanterdir. Bu yüzden birbirine tamamen komplemanter iki adet tek sarmal nükleik asit dizisi kolaylıkla birbirine bağlanır. Buna "yapışma" adı verilir. İki dizilimdeki tek nükleotit farklılığı bile yapışmayı zorlaştırır.
Bu işlemin tersine "denatürasyon" ya da "erime" adı verilir. Çift sarmallı bir DNA molekülü ısı veya pH ile denatüre edilebilir. Bu durumda çift sarmal açılıp tek sarmallı iki yapı haline gelir.
DNA’nın hibritleşme ve denatüre olma özelliğinden birçok moleküler teknikte yararlanılmaktadır.
Polimeraz zincir tepkimesi
Polimeraz Zincirleme Tepkimesi (Polymerase Chain Reaction - PCR), DNA içerisinde yer alan, dizisi bilinen iki segment arasındaki özgün bir bölgeyi enzimatik olarak çoğaltmak için uygulanan tepkimelere verilen ortak bir isimdir.
Metod basitçe tüp içerisinde nükleik asitlerin uygun kosullarda çoğaltılması esasına dayanır. Bir çeşit "in vitro klonlama" olarak da tanımlanan PCR; 94°C-98°C aralığında gerçekleştirilen denatürasyon, 37°C-65°C aralığında gerçekleştirilen tavlama (İng. annealing) ve 72°C’de gerçekleştirilen uzama aşamalarından oluşur ve bu döngülerin belirli sayıda tekrarlanmasına dayanır.
PCR yönteminin gelişmesinde en büyük katkıyı Taq Polimeraz enziminin bulunması yapmıştır çünkü bu enzim yüksek sıcaklıklarda dahi dayanabilen tek enzimdir. Bu enzim Kızıldeniz’in sıcak bölgelerinden birinde yaşayan bir mikroorganizmadan elde edilmiştir. Dr. Kary B. Mullis 1980’li yıllarda yaptığı PCR çalışmaları ile 1993 yılında Kimya alanında Nobel ödülü almıştır.
PCR yaygın olarak tıbbi ve biyolojik araştırma laboratuvarlarında kalıtsal hastalıkların teşhisi, genetik parmak izlerinin tanımlanması, bulaşıcı hastalıkların teşhisi, genlerin klonlanması, babalık testi ve DNA hesaplaması gibi değişik konularda yaygın bir şekilde kullanılmaktadır.
PCR yöntemine dayalı olarak birçok primer olarak adlandırılan başlatıcı DNA teknikleri geliştirilmiştir. bu başlatıcı DNA’lar belli dizilere sahip ve sentetik olarak üretilebilen moleküllerdir. PCR’a dayalı RAPD, AFLP, SSR ve ISSR gibi markör teknikleri geliştirilmiştir. Bu teknikler birçok bitki ve hayvanda genetik akrabalığın teşhisinde türiçi ve türlerarasında kullanılmaktadır.
1980’lerin başında geliştirilen rekombinant teknoloji, deoksiribonükleik asit (DNA) kullanarak hormon üretim yöntemidir.
Rekombinant DNA teknolojisi
Rekombinant DNA teknolojisi, doğada kendiliğinden oluşması mümkün olmayan, çoğunlukla farklı biyolojik türlerden elde edilen DNA moleküllerinin, genetik mühendislik teknolojisiyle kesilmesine ve elde edilen farklı DNA parçalarının birleştirilmesi işlemlerini kapsayan bir teknolojidir. Rekombinant DNA ise; bu işlem sonucu üretilmiş olan yeni DNA molekülüne verilen isimdir ve kısaca rDNA olarak yazılır.
Bu alanda yapılan işlemler, kısaca genlerin herhangi bir organizmadan alınarak üretilmesi (klonlama) ve üretilen genlerin gerek temel, gerekse uygulamalı araştırmalar için kullanıması olarak özetlenebilir. Bu teknoloji bugün temel bilimler, tıp, endüstri, hayvancılık, ziraat, çevre mühendisliği gibi alanlarda yaygın bir biçimde kullanılmaya başlamıştır.
Tanım ve amaç
Bu teknolojinin bilimsel temeli olan çeşitlenme (rekombinasyon) genetik bir olaydır ve doğada canlılar arasında görülen çeşitliliğin önemli nedenlerinden birini oluşturur. Rekombinasyon; farklı genotipteki bireyler arasında eşleşmeler söz konusu olduğunda, ana-babaya ait kalıtsal özelliklerin dölde değişik gruplanmalar halinde bir araya gelmesine yol açan olaylar dizisidir. Bu olay moleküler düzeyde, farklı nükleotid dizilerine sahip iki DNA molekülünün homoloji gösteren bölgeleri arasındaki parça alış-verişi sonucunda meydana gelen yeni gruplamalardır. Bunun için DNA molekülleri arasında kırılmalar meydana gelir ve kırılma bölgelerinde DNA molekülleri arasında parça alış-verişi oluşur. Sonuçta orijinal durumdaki DNA moleküllerine tam olarak benzemeyen ve onlara ait nükleotid dizilerini kısmen taşıyan rekombinant DNA molekülleri oluşur.
Homolog çeşitlenme (rekombinasyon), eşeyli üremeyle genelde mayoz bölünmedeki kromozomal parça değişimi sonucunda meydana gelir. Bakterilerde çeşitlenme farklı işleyişlerle, transformasyon, konjugasyon ve trandüksiyon olaylarıyla görülür. Bu olayların hepsinin temeli DNA molekülleri arasında homoloji olmasına dayanmaktadır. Bu yüzden doğada çeşitlenme, aynı türe ait bireyler arasında ya da çok yakın türler arasında kısıtlıdır. Farklı türler arasında varolan çeşitli düzeydeki eşleşme engelleri farklı türlere ait bireyler arasında genetik bilgi aktarımına, dolayısıyla da rekombinasyona olanak sağlamamaktadır.
Rekombinant DNA teknolojisinin tanımı ve kapsamı çeşitli toplumlara ya da biliminsanlarına göre farklılıklar göstermektedir. Bununla birlikte, bu değişik tanımlar arasında hepsindeki ortak yönleri birleştiren, oldukça geniş ve günümüzün modern ölçütlerine uygun bir tanım şu şekilde yapılabilir: Rekombinant DNA teknolojisi, bir canlıdan herhangi bir yolla yalıtılan bir genin uygun bir konağın içerisine sokularak orada çoğaltılmasını ve bazen de ifade edilmesini amaçlayan çalışmalar ait tekniklerin toplamıdır.
Belirli bir amaç için doğrudan genetik materyal üzerinde yapılan bu teknolojiyle, in vitro şartlarda genetik materyalde planlı değişiklikler yapılabilmekte, istenilen genlerin istenilen canlıya sokularak, doğal biçimde bulunmadığı bu konakta çoğaltılması ve istenilen ürünü vermesi için nakledilen genin ifadesi sağlanabilmektedir. Bu teknolojiyle, prokaryotik ve ökaryotik gruplara ait türlerin kendi aralarında olduğu kadar, gruplar arasında da gen aktarımları yapmak ve çeşitlilikler meydana getirmek mümkün olmaktadır.
Tarihçe
Rekombinant DNA teknolojisi özellikle 1960’lı yılların sonlarına doğru DNA ile ilgili bazı enzimlerin etki mekanizmalarının anlaşılması sayesinde gerçekleştirilen bir dizi yöntemleri kapsamaktadır. Bununla birlikte bu süreç 1940’lardan 70’lere kadar moleküler biyolojinin gelişmesini sağlayan bilgi birikimi de rekombinant DNA teknolojisinin temelini oluşturmuştur.
Genetik çeşitlenme olaylarının yapay olarak gerçekleştirilmesi esasına dayanan rekombinant DNA teknolojisine (rDNA) ilişkin ilk çalışmalar, 1973 yılında başta Cohen olmak üzere bir araştırma grubunun önderliğinde in vitro koşullarda gerçekleşmiştir. Buna göre doğada eldesi imkânsız olan yeni gen düzenlemelerinin yapılması bu teknolojiyle sağlanabilmekte, bir canlının genotipi önceden belirlenebilmekte ve yönlendirilebilmektedir. In vitro koşullarda oluşturulan yeni DNA moleküllerine önceleri "kimera" (aslan başlı, keçi gövdeli ve yılan kuyruklu mitolojik bir yaratık) adı verilmiştir. Bu kimeralar, birbirleriyle ilişkili olmayan ve farklı kökenler ait genleri içeren rekombinant DNA molekülleridir.
Rekombinant DNA teknolojisi 1980’li yıllarda dev adımlarla ilerlemiş ve günümüzde adından en çok bahsedilen ve moleküler genetikte devrim yaratan bir bilim dalı olmuştur.
Özellikle 1985’de ortaya atılan bir veya iki hücreden elde edilen DNA’nın birkaç saat içersinde çoğaltılarak 24 saatte genetik tanının konmasına olanak sağlayan Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) rDNA teknolojisi için belki en büyük gelişmelerden biri olarak kabul edilebilir.
Uygulama
Rekombinant DNA teknolojisinde izlenen olayların sırası şu şekilde özetlenebilir;
Bir canlıdan elde edilen, istenilen özellikteki (yalıtılmış) DNA parçalarının taşıyıcı özellikteki bir DNA molekülüne (vektöre) bağlanması ve rekombinant DNA eldesi,
Rekombinant DNA moleküllerinin uygun bir konak hücreye sokulma (transformasyon, transdüksiyon veya konjugasyon ile)
rDNA’nın konak hücrede çoğaltılması (gen çoğaltımı) ve hücre bölünmesi,
Yavru hücrelerde yeni genin ifadesi ve ürünün eldesi.
Rekombinant DNA teknolojisinde uygulanan yöntemler 3 ana başlık halinde incelenebilir;
Klasik uygulamalar
Hibritleşme yöntemleri
Polimeraz zincir reaksiyon yöntemi
Rekombinant DNA teknolojisi uygulamaları özellikle genetik mühendisliği ve biyoteknolojide kullanılımaktadır. Dünya nüfusunun %3-5’nin genellikle tedavi olanağı bulmayan kalıtsal hastalıklardan etkilendiği bilinmektedir. Bu alandaki en büyük ümit ve beklenti genetik bozuklukların gen aktarımı yöntemleriyle düzeltilmesi ya da etkin tedavi yöntemlerinin geliştirilmesidir. Kısa zamanda çok geniş bir uygulama alanı bulan bu yöntemin gerçek değeri önümüzdeki yıllarda çok daha iyi anlaşılacaktır.
Genetik Mühendisliği
Genetik mühendisliği, canlıların kalıtsal özelliklerinin değiştirilerek, onlara yeni işlevler kazandırılmasına yönelik araştırmalar yapan bilim alanıdır. Bu uygulamalarla uğraşan bilim insanlarına "genetik mühendisi" denir. Genetik mühendisleri, genlerin yalıtılması, çoğaltılması, farklı canlıların genlerinin birleştirilmesi ya da genlerin bir canlıdan başka bir canlıya aktarılması gibi çalışmalarla uğraşırlar. Genetik mühendisliği için, rekombinant DNA teknolojisi, gen klonlaması, DNA klonlaması, genetik manüplasyon/modifikasyon veya gen ekleme (splays) birçok bilim insanınca eş anlamlı olarak kullanılabilmektedir.
Genetik mühendisliği etki alanı son derece geniş bir meslek, bilim ve mühendislik dalı olup, genlerle yapılabilen uygulamalar, çalışmalar anlamına gelmektedir. Birçok bilim dalına ait bilgilerin ve çeşitli özel tekniklerin, canlılarla ilgili temele ve uygulamaya ait sorunların çözülmesi için genellenecek olursa, moleküler biyoloji hakkındaki bilgimizin artmasına yardım eden çok etkili bir araştırma aracıdır da.
Gregor Mendel genetiğin ve bu bilimle ilgili yapılan çalışmaların kurucusu olarak kabul edilip, "Genetiğin Babası" olarak anılmaktadır.
Gen yalıtımı (izolasyonu)
Gen yalıtımı veya izolasyonu, rekombinant DNA teknolojisinde, bir canlıya herhangi bir genin istenilen yön ve biçimde yeni bir düzenleme içine sokulmasındaki ilk aşamadır. Bu yöntemle ilgilenilen geni taşıyan DNA parçaları elde edilir. İşlem için değişik yollar kullanılabilir. Bu yöntemler şu şekilde sıralanabilir:
1. Genellikle kullanılan yöntemlerden biri, bir canlıdan yalıtılan ve saflaştırılan DNA moleküllerini, çift zincirli yapılarını bozmadan parçalamaktadır.
Çoğaltılması istenilen gen parçaları bu parçalardan birinin içinde bulunur. DNA’nın parçalanması için bazı mekanik (kontrollü çalkalama, ultrason uygulaması gibi) yöntemlerden yararlanılmakta birlikte, günümüzde en başarılı sonuçlar kesme enzimleri (restriksiyon endonükleazlar) ile sağlanmaktadır.
2. Diğer bir yöntem ise DNA kopyasının (cDNA) eldesidir.
Bunun için hücrelerden klonlanması amaçlanan genin transkripsiyon ürününü de içeren RNA yalıtılır. Daha sonra ters (revers) transkriptaz enzimiyle bu RNA moleküllerinin tamamlayıcısı olan DNA kopyaları çıkarılır. Meydana gelen RNA/DNA melezinin RNA kısmı enzimin ribonükleaz H aktivitesiyle hidroliz edilip yok edilir, daha sonra DNA polimeraz aktivitesiyle cDNA çift zincirli hale getirilir. Bu yöntem özellikle fazla miktarda DNA içeren karmaşık gen yapısı gösteren ve çoğu geninde intron bulunan ökaryotik canlılardan gen yalıtımı için kullanılmaktadır. Elde edilen DNA parçalarının içinde bazıları çoğaltılmak istenilen gen parçasını taşırlar. Farklılaşmış ve çok az çeşitte proteinlerin sentez edildiği hücrelerde ise bu olasılık daha yüksek olur. Bu yöntem özellikle ökaryotik genlerin prokaryotlara klonlanmasında kullanılmaktadır.
3. Son yıllarda çok başarılı sonuçlar sağlayan başka bir yöntem de, Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) ile gen yalıtımıdır.
1986 yılında geliştirilen PCR yöntemi DNA moleküllerindeki istenilen gen bölgesinin canlı hücre içine sokulmadan yalıtılıp çoğaltılmasına olanak verir. Genomdan seçilen küçük miktardaki bir gen bölgesinin bile milyonlarca kopyası bu yöntemle yapılabilmektedir. Bunun için sadece bu dizinin, en azından bir kısmının önceden biliniyor olması gerekmektedir. PCR ürünü DNAlar klonlamanın yanı sıra dizi analizi, hastalık tanısı, genetik tarama gibi çeşitli amaçlar için de kullanılabilmektedir. PCR, rekombinant DNA teknolojilerinin etkinliğini ve gücünü arttırmış, hatta bazı yöntemlerin yerini almıştır.
Gen çoğaltımı (klonlaması)
Moleküler klonlama, Gen çoğaltımı veya Gen klonlaması, rekombinant DNA moleküllerinin uygun bir konak hücreye sokularak orada çoğaltılması işlemine verilen addır.
Rekombinant DNA teknolojisi genelde, bir organizmadan elde edilen ve içinde istenilen geni taşıyan DNA parçalarının, taşıyıcı özellikte bir DNA molekülüne bağlanarak rekombinant DNA (cDNA) oluşturulması, rekombinant DNA moleküllerinin uygun bir konak hücreye sokularak orada çoğaltılmasını kapsayan bir süreci izlemektedir. Bu sürecin tanımlanmış bir DNA dizisinin yalıtımı (izolasyonu) ve daha sonrasında bunun birçok kopyasını in vivo koşullarda üretme aşamalarını kapsayan kısmı ise gen klonlamasıdır.
Klonlama, çoğunlukla gen içeren DNA parçalarının kuvvetlendirilmesi için kullanılsa da, DNA’nın promotorlar, kodlanmamış diziler, kimyasal sentezlenmiş oligonükleotidler gibi kısımlarını ve nadiren kırılmış DNA’yı kuvvetlendirmek için de kullanılabilir.
Bu süreçte konak hücreler çoğladıkça rekombinant DNA molekülleri döllere geçerler ve yavru hücrelerde de kopya sayılarını arttırırlar. Çok sayıda hücre bölünmesini takiben oluşan bir klonda hücrelerin her birinde istenilen geni taşıyan cDNA moleküllerinin bir ya da daha fazla sayıda kopyası bulunur. Buna göre, gen klonlaması (ya da DNA klonlaması) tek bir genden kökenlenen ve hepsi birbirinin ayn olan bir DNA populasyonu elde etmektedir. Bu teknolojiyle ayrıca çoğu kez klonlanmış bir genin kendisi için yeni konakta ifade edimin (ekspresyonun) sağlanmasıyla ürünün eldesi de amaçlanmaktadır.
Moleküler klonlama, biyoloji deneylerinin ve yüksek oranda protein üretimi gibi teknolojik uygulamaların çoğunda yarar sağlamaktadır
Hibritleşme
DNA hibritleşmesi; birbirine eşlenik iki adet tek sarmal nükleik asit dizisinin çift sarmallı tek bir yapı haline gelmesi işlemidir.
Yapay olarak çoğaltılmış ve DNA probları olarak hazırlanmış olan spesifik DNA frangmentlerinin niteliği araştırılacak olan hedef DNA molekülü ile birleştirilmesi işlemine "hibridizasyon" denir.
Nükleotitlerin, normal şartlar altında kendilerine karşılık gelen eşlerine bağlanma özellikleri vardır. DNA’da Guanin ile Sitozin ve Adenin ile Timin birbirine komplemanterdir. Bu yüzden birbirine tamamen komplemanter iki adet tek sarmal nükleik asit dizisi kolaylıkla birbirine bağlanır. Buna "yapışma" adı verilir. İki dizilimdeki tek nükleotit farklılığı bile yapışmayı zorlaştırır.
Bu işlemin tersine "denatürasyon" ya da "erime" adı verilir. Çift sarmallı bir DNA molekülü ısı veya pH ile denatüre edilebilir. Bu durumda çift sarmal açılıp tek sarmallı iki yapı haline gelir.
DNA’nın hibritleşme ve denatüre olma özelliğinden birçok moleküler teknikte yararlanılmaktadır.
Polimeraz zincir tepkimesi
Polimeraz Zincirleme Tepkimesi (Polymerase Chain Reaction - PCR), DNA içerisinde yer alan, dizisi bilinen iki segment arasındaki özgün bir bölgeyi enzimatik olarak çoğaltmak için uygulanan tepkimelere verilen ortak bir isimdir.
Metod basitçe tüp içerisinde nükleik asitlerin uygun kosullarda çoğaltılması esasına dayanır. Bir çeşit "in vitro klonlama" olarak da tanımlanan PCR; 94°C-98°C aralığında gerçekleştirilen denatürasyon, 37°C-65°C aralığında gerçekleştirilen tavlama (İng. annealing) ve 72°C’de gerçekleştirilen uzama aşamalarından oluşur ve bu döngülerin belirli sayıda tekrarlanmasına dayanır.
PCR yönteminin gelişmesinde en büyük katkıyı Taq Polimeraz enziminin bulunması yapmıştır çünkü bu enzim yüksek sıcaklıklarda dahi dayanabilen tek enzimdir. Bu enzim Kızıldeniz’in sıcak bölgelerinden birinde yaşayan bir mikroorganizmadan elde edilmiştir. Dr. Kary B. Mullis 1980’li yıllarda yaptığı PCR çalışmaları ile 1993 yılında Kimya alanında Nobel ödülü almıştır.
PCR yaygın olarak tıbbi ve biyolojik araştırma laboratuvarlarında kalıtsal hastalıkların teşhisi, genetik parmak izlerinin tanımlanması, bulaşıcı hastalıkların teşhisi, genlerin klonlanması, babalık testi ve DNA hesaplaması gibi değişik konularda yaygın bir şekilde kullanılmaktadır.
PCR yöntemine dayalı olarak birçok primer olarak adlandırılan başlatıcı DNA teknikleri geliştirilmiştir. bu başlatıcı DNA’lar belli dizilere sahip ve sentetik olarak üretilebilen moleküllerdir. PCR’a dayalı RAPD, AFLP, SSR ve ISSR gibi markör teknikleri geliştirilmiştir. Bu teknikler birçok bitki ve hayvanda genetik akrabalığın teşhisinde türiçi ve türlerarasında kullanılmaktadır.
Hiç yorum yok:
Yorum Gönder